Размножение и рост дрожжей

Пивоваренные дрожжи в нормальных условиях обычно размножаются почкованием и лишь очень редко делением клеток или спорообразованием.

Размножению каждой клетки предшествует деление клеточного ядра. До сих пор не удалось однозначно доказать, делится ли ядро клетки прямо или косвенно. Прямое деление ядра (амитаза) - это форма, при которой ядро просто распадается на две части без участия хромосом.

При непрямом делении (митозе) ядро делится с хромосомами так же, как у высших животных и растений. Это сложный процесс, в котором различают четыре фазы.

В начальной фазе (профазе) клеточное ядро освобождается и появляются хромосомы, их число у каждого вида дрожжей постоянно; они распределяются и на них появляется продольная черта, по которой они позже делятся. В метафазе ядерная оболочка растекается, и хромосомы стягиваются в экваториальной плоскости, где располагаются кольцом. В начале анафазы хромосомы делятся продольно и гомологическими парами поднимаются и направляются к полюсам, т. е. к местам будущих ядер. В телофазе хромосомы опять исчезают и образуются дочерние ядра, которые покрываются оболочкой.

Вегетативное размножение

При почковании материнская клетка образует почку, которая вырастает в дочернюю клетку. У низовых пивоваренных дрожжей дочерняя клетка отделяется, как только достигает определенного размера, в то время как у верховых дрожжей не отделяется сразу, а образует клеточные соединения кустообразной формы. Культурные пивные дрожжи почкуются всегда полярно (если они круглые). Каждая клетка может почковаться многократно. В месте отделения дочерней клетки на материнской клетке остается заметный шрам, по количеству этих шрамов, хорошо видимых под электронным микроскопом или флюоресцентным микроскопом после окрашивания, можно судить о возрасте клетки.

Условием размножения клеток является культивация в среде, содержащей все необходимые питательные вещества (сахариды, азотистые и минеральные вещества) и факторы роста в необходимом количестве. Такой средой является пивное сусло.

Рост дрожжевой культуры лучше всего заметен по кривым роста, выражающим зависимость числа клеток в единице объема среды от времени. По их ходу различают обычно четыре фазы роста.

1. Латентная фаза (начальная стационарная фаза, лаг-фаза), в которой культура в течение нескольких часов приспосабливается к новой среде, прежде чем начнется рост. Латентная фаза обычно по времени совпадает с индукционным периодом спиртового брожения.

2. Логарифмическая фаза характеризуется наиболее бурным ростом культуры, которая размножается по логарифмической кривой, так что прирост наибольший. В этой фазе спиртовое брожение еще в индукционном периоде и только позднее происходит разбраживание. В производственном брожении оно всегда оканчивается в стадии образования белых завитков.

3. Максимальная стационарная фаза отвечает достижению границы роста кривой и прирост начинает падать. Молодые клетки подрастают и выравниваются морфологически и физиологически. Спиртовое брожение достигает высшей точки, а активность ферментов ослабевает. В производственном брожении эта фаза совпадает со стадией белых завитков.

4. Фаза замедления (ингибиции) роста наступает под влиянием скопления в среде метаболитов и снижения концентрации сахаров. Рост дрожжей замедляется и наконец прекращается.

Температурный оптимум размножения и роста дрожжей находится между 25 и 30°С. При температурах выше 40°С рост прекращается, и клетки умирают. Низкие температуры, при которых проводится низовое брожение, замедляет рост, однако дрожжи не портятся. Очень низкие температуры лучше выдерживают прессованные дрожжи, чем жидкие.

В пивном сусле удовлетворительного состава количество дрожжей, использованных для сбраживания, не оказывает существенного влияния на количество дрожжей, полученных при брожении. При концентрации сахара в среде от 20% и выше дрожжи не размножаются и не бродят. Это объясняется плазмолизом дрожжевых клеток под влиянием высокого осмотического давления. Только дрожжи "осмофильные" выносят более высокую концентрацию сахара.

Из метаболитов рост дрожжей замедляют углекислый газ и этанол в концентрации, начиная с 6%; только некоторые виды 270 пивных дрожжей выносят концентрацию до 10%. Это зависит от физиологического состояния дрожжей и от состава сусла. Высокая концентрация сахара, низкий pH и повышенная температура снижают стойкость дрожжей в отношении спирта [7]. Высшие спирты, образующиеся при брожении, в значительной мере подавляют рост дрожжей [6].

Тяжелые металлы (железо, медь) в незначительных количествах (до нескольких миллиграммов) активизируют размножение дрожжей, а большие количества этих же металлов его подавляют [7]. Небольшие количества железа и меди, обычно содержащиеся в производственном сусле, не влияют на рост дрожжей.

Нитраты, образующиеся при восстановлении нитритов из производственной воды, при концентрации свыше 25 мг NO₃/л могут тормозить низовое брожение.

Спорообразование и наследственные свойства

Пивоваренные дрожжи, как уже было сказано, образуют споры с трудом; несмотря на это в последнее время спорообразование используется для получения мутантов с измененными свойствами.

Дрожжи образуют споры, если долгое время выдерживаются в неблагоприятных условиях, например, на куске гипса или на агаре, бедном питательными веществами. Дрожжи образуют шарообразные споры небольшого размера (2-3 мкм), содержащиеся в сумке (ascus), чаще всего по 4 шт. Споры более стойки к вредному действию высоких температур и антисептиков и к автолизу. При перенесении спор в среду, обеспечивающую хорошие условия питания, споры прорастают и образуют новые клетки.

При прорастании спор без предварительной копуляции образуются более мелкие, так называемые редуцированные формы, а нормальные большие клетки образуются после копуляции редуцированных форм парами. Это первым доказали Круис и Шатава [9]. Позже Винге и Лаустсен [10] получили копуляцией спор разных дрожжей потомства, отличающиеся наследственными признаками, как это вытекает из смешения хромосом, гены которых переносят основные наследственные признаки.

Пивоваренные дрожжи и большая часть остальных промышленно важных дрожжей содержат в клеточном ядре все хромосомы по паре, так что они диплоидны [9, 10]. При вегетативном размножении клеток делением каждая хромосома делится вдоль на две части (митоза). Половина остается в материнской клетке, а другая половина переходит в дочернюю клетку, которая, следовательно, тоже диплоидна, и поэтому сохраняет наследственные признаки материнской клетки.

При спорообразовани в сумке образуются сначала четыре ядра, из которых каждое содержит только по одной хромосоме, так что они гаплоидны. При сгущении плазмы вокруг каждого ядра образуются споры (ascospory) морфологически одинаковые. Однако физиологически они отличаются своими хромосомами, которые образовались при делении пар типа a/α, так что две содержат хромосомы типа a, а две другие - типа α. В зависимости от жизненных условий две из четырех спор сумки тотчас взаимно копулируют или прорастают в гаплоидной единице; генетически разнополые единицы (гетерофалические) могут соединяться (а+α) и из них взойдет следующее диплоидное потомство a/α.

Под действием некоторых влияний могут образоваться культуры с большим числом хромосом (полиплоидные), например триплоидные, тетраплоидные и т. д. Такие клетки бывают большими и считаются полиплоидными мутантами.

При половом размножении образуются мутанты и гибриды с собственными, отличными от исходной культуры, свойствами. Искусственное скрещивание при копуляции спор было использовано для получения новых рас (Торн, Джиллиланд). В условиях производства и также в культурах искусственно выращиваемых, как правило, не происходит полового размножения. Пивоваренные дрожжи из лабораторных культур большей частью утратили способность к спорообразованию в результате образования стерильных мутантов [11, 12].

Условия для самопроизвольного полового размножения дрожжей, применяемых в промышленности, подробно не изучены. Однако, если нужно сохранить у технических культур исходные свойства расы, то половое размножение в культурах нежелательно.

Наследственные признаки дрожжей можно до определенной степени изменять также отбором спонтанно образующихся мутантов искусственным вмешательством, вызывающим мутацию, например, действием химикатов или разными видами облучения. Так получаются биохимические мутанты с вновь созданными или обновленными способностями синтезировать одно или несколько веществ, необходимых для роста, а также мутанты, которые утратили эту способность.

Наблюдалось также образование мутантов путем изменения состава цитоплазмы, вероятно митохондрий (рис. 62). По данным автора, мутации такого типа встречаются чаще, чем мутации ген, и обычно их вызывает потеря какого-нибудь фермента, который дрожжи уже не может синтезировать.

Рис. 62. Схема гетерофалического цикла развития дрожжей по Эфрусси