Ферменты солода и их субстраты

Ферменты, расщепляющие крахмал

Гидролитическое расщепление крахмала (амилолиз) при затирании катализируют амилозы солода. Кроме них солод содержит несколько ферментов из групп амилоглюкозидаз и трансфераз, которые атакуют некоторые продукты расщепления крахмала; однако по количественному соотношению они имеют при затирании только второстепенное значение.

При затирании природным субстратом является крахмал, содержащийся в солоде. Так же как любой природный крахмал, он не является единым химическим веществом, а смесью, содержащей в зависимости от происхождения от 20 до 25% амилозы и 75-80% амилопектина.

Молекула амилозы образует длинные, неразветвленные, спиральносвернутые цепочки, состоящие из молекул α-глюкозы, взаимно связанных глюкозидными связями в положении α-1,4. Количество глюкозных молекул различно и колеблется от 60 до 600. Амилоза растворима в воде и окрашивается йодным раствором в синий цвет. По Мейеру [1], амилоза под действием β-амилазы солода полностью гидролизуется до мальтозы.

Молекула амилопектина состоит из коротких разветвленных цепочек. Наряду со связями в положении α-1,4, в разветвленных местах встречаются также связи α-1,6. Глюкозных единиц в молекуле насчитывается около 3000. Ячменный амилопектин содержит их, по Мак Леоду [2], от 24 до 26, в то время как солодовый только 17-18. Амилопектин без нагрева нерастворим в воде, при нагреве образует клейстер.

Солод содержит две амилазы, расщепляющие крахмал до мальтозы и декстринов. Одна из них катализирует реакцию, при которой быстро исчезает синяя окраска с йодным раствором, однако мальтозы образуется относительно мало; эта амилаза называется декстринирующей или α-амилазой (α-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, ЕК 3.2.1 Л.). Под действием второй амилазы синяя окраска с йодным раствором исчезает только тогда, когда образуется большое количество мальтозы; это амилаза осахаривающая или β-амилаза (β-1,4-глюканмальтогидролаза, ЕК 3.2.1.2)^*.

^* (Обозначения α и β относятся к оптической форме образующегося сахара (α-мальтоза или β-мальтоза).)

Декстринирующая α-амилаза. Она является типичным компонентом солода. α-Амилаза активизируется при солодоращении, однако в ячмене Кнеен обнаружил ее только в 1944 г. [3]. Она катализирует расщепление α-1,4 глюкозидных связей. Молекулы обоих компонентов крахмала, т. е. амилозы и амилопектина, при этом неравномерно разрываются внутри; только конечные связи, не гидролизуются. Происходит разжижение и декстринизация проявляющаяся в быстром снижении вязкости раствора (разжижение затора). Разжижение крахмального клейстера является одной из функций солодовой α-амилазы. Представление об участии другого разжижающего фермента (амилофосфатазы) в настоящее время не считается обоснованным. Характерно, что α-амилаза вызывает исключительно быстрое снижение вязкости крахмального клейстера, восстанавливающая способность которого при этом возрастает очень медленно. Синяя йодная реакция крахмального клейстера (т. е. раствора амилопектина) под действием α-амилазы быстро изменяется через красную, бурую да ахроической точки, а именно при низкой восстанавливающей способности.

В естественных средах, т. е. в солодовых экстрактах и заторах, аα-амилаза имеет температурный оптимум 70°С; инактивируется при 80°С. Оптимальная зона pH равна от 5 до 6 с четким максимумом на рН-кривой. Она стабильна в диапазоне pH от S до 9. аα-Амилаза очень чувствительна к повышенной кислотности (является кислотонеустойчивой); инактивируется окислением да pH 3 при 0°С или до pH 4,2-4,3 при 20°С.

Осахаривающая β-амилаза. Она содержится в ячмене и ее объем при соложении (проращивании) сильно возрастает. β-Амилаза обладает высокой способностью катализировать расщепление крахмала до мальтозы. Она не разжижает нерастворимый нативный крахмал и даже крахмальный клейстер.

Из неразветвленных цепочек амилазы β-амилаза отщепляет вторичные α-1,4 глюкозидные связи, а именно от невосстанавливающихся (неальдегидных) концов цепей. Мальтоза постепенно отщепляет от отдельных цепочек по одной молекуле. Расщепление амилопектина происходит также, однако фермент атакует разветвленную молекулу амилопектина одновременно в нескольких пространственных цепочках, а именно в местах разветвления, где находятся связи α-1,6, перед которыми расщепление прекращается.

Вязкость крахмального клейстера под действием α-амилазы снижается медленно, в то время как восстанавливающая способность возрастает равномерно. Йодная окраска переходит из синей очень медленно в фиолетовую, а потом в красную, однако ахроической точки вообще не достигает.

Температурный оптимум β-амилазы в солодовых экстрактах и заторах находится при 60-65°С; она инактивируется при 75°С. Оптимальная зона pH равна 4,5-5, по другим данным - 4,65 при 40-50°С с нерезким максимумом на рН-кривой.

Общее действие α- и β-амилазы. Амилаза (диастаза), содержащаяся в солоде обычных типов и в специальном диастатическом солоде, является природной смесью α- и β-амилазы, в которой β-амилаза количественно преобладает над α-амилазой.

При одновременном действии обеих амилаз гидролиз крахмала намного глубже, чем при самостоятельном действии одного из названных ферментов, и мальтозы при этом получается 75-80%.

Осахаривание амилозы и конечных групп амилопектина β-амилаза начинает с конца цепочек, в то время как α-амилаза атакует молекулы субстрата внутри цепочек.

Низшие и высшие декстрины образуются наряду с мальтозой под действием α-амилазы на амилозу и амилопектин. Высшие декстрины образуются также под действием β-амилазы на амилопектин. Декстрины являются разновидностью эритрогранулозы и α-амилаза разрывает их вплоть до α-1,6 связей, так что образуются новые центры для действия β-амилазы. Тем самым α-амилаза повышает активность β-амилазы. Кроме того, α-амилаза атакует декстрины типа гексозы, образующиеся под действием β-амилазы на амилозу.

Декстрины с нормальными прямыми цепочками осахариваются обеими амилазами. При этом β-амилаза дает мальтозу и немного мальтотриозы, а α-амилаза - мальтозу, глюкозу и мальтотриозу, которая дальше расщепляется до мальтозы и глюкозы. Декстрины с разветвленными цепочками рвутся до мест разветвления. При этом образуются низшие декстрины, иногда олигосахариды, главным образом трисахариды и изомальтоза. Таких разветвленных остаточных продуктов, которые ферменты дальше не гидролизуют, насчитывается около 25-30% и они называются конечными декстринами.

Разницу температурного оптимума α- и β-амилазы на практике используют для регулировки взаимодействия обоих ферментов тем, что подбором правильной температуры поддерживают деятельность одного фермента в ущерб другому.

Амилоглюкозидазы солода, например α- и β-глюкозидаза, β-h-фруктозидаза, - это гидролизующие ферменты, реагирующие точно так же, как амилазы, которые, однако, гидролизуют не крахмал, а только некоторые продукты расщепления.

Трансглюкозидазы, скорее негидролизующиеся ферменты, однако механизм катализированных ими реакций подобен механизму гидролаз. В солоде содержатся трансглюкозидазы, фосфорилирующие или фосфорилазы, и нефосфорилирующие, например циклодекстриназа, амиломальтаза и др. Все эти ферменты катализируют перенос сахарных радикалов. Их технологическое значение второстепенное.

Ферменты, расщепляющие белковые вещества

Расщепление белков (протеолиз) катализируют при затира-нии ферменты из группы пептидаз или протеаз (пептид гидролаз, ЕК 34), гидролизующие пептидные связи = СО = NH =. Они делятся на эндопептидазы, или протеиназы (пептид пептидогидролазы, ЕК 3.44) и экзопептидазы или пептидазы (дипептид гидролазы, ЕК 3.4.3).

В заторах субстратами являются остатки белкового вещества ячменя, т. е. лейкозина, эдестина, гордеина и глютелина, частично измененного при соложении (например, коагулированного при сушке) и продукты их расщепления, т. е. альбумозы, пептоны и полипептиды.

Некоторые белковые вещества образуют открытые цепи связанных пептидными связями аминокислот со свободными концевыми аминными группами = NH₂ И карбоксильными группами = СООН. Кроме них в молекуле белков могут находиться аминогруппы диаминокарбоновых кислот и карбоксильные группы дикарбоновых кислот. До тех пор пока некоторые белки имеют пептидные цепи, замкнутые в кольца, они не имеют конечных аминных и карбоксильных групп.

Ячмень и солод содержат один фермент из группы эндопептидаз (протеиназ) и не менее двух эксопептидаз (пептидаз). Их гидролизующее действие взаимно дополняется.

Эндопептидаза (протеиназа). Как настоящая протеиназа, ячменная и солодовая эндопептидаза гидролизует внутренние пептидные связи протеинов. Макромолекулы белков при этом расщепляются на меньшие частицы, т. е. полипептиды с меньшей молекулярной массой. Точно так же, как остальные протеиназы, ячменная и солодовая протеиназа действуют активнее на измененные белки, например денатурированные, чем на белки нативные.

По своим свойствам ячменная и солодовая протеиназы относятся к ферментам типа папаина, очень распространенным в растениях. Их оптимальная температура находится между 50-60°С, оптимум pH колеблется от 4,6 до 4,9 в зависимости от субстрата. Протеиназа относительно стабильна при высоких температурах и тем самым отличается от пептидаз. Наиболее стабильна она в изоэлектрической области, т. е. при pH от 4,4 до 4,6. По Кольбаху, активность фермента в водной среде снижается уже спустя 1 ч при 30°С; при 70°С через 1 ч он полностью разрушается.

Гидролиз, катализированный солодовой протеиназой, протекает постепенно. Между белками и полипептидами было выделено несколько промежуточных продуктов, из которых важнейшими являются пептоны, называемые также протеозы, альбумозы и т. д. Это высшие продукты расщепления коллоидного характера, которые имеют типичные свойства белков. Они осаждаются в кислой среде танином, однако при биуретовой реакции (т. е. реакции с сернокислой медью в щелочном растворе белка) окрашиваются в розовый цвет вместо фиолетового. При кипячении пептоны не коагулируют. Растворы имеют активную поверхность, они вязки и при встряхивании легко образуют пену.

Последнюю степень расщепления белков, катализированных солодовой протеиназой, представляют полипептиды. Они только отчасти являются высокомолекулярными веществами с коллоидными свойствами. Нормально полипептиды образуют молекулярные растворы, легко диффундирующие. Как правило, они не реагируют как белки и не осаждаются танином. Полипептиды являются субстратом пептидаз, которые дополняют действие протеиназы.

Экзопептидазы (пептидазы). Комплекс пептидаз представлен в солоде двумя ферментами, однако допускается наличие и других.

Пептидазы катализируют отщепление терминальных остатков аминокислот от пептидов, причем сначала образуются дипептиды и, наконец, аминокислоты. Пептидазы характеризуются субстратной специфичностью. Среди них имеются и дипептидазы, гидролизующие только дипептиды, и полипептидазы, гидролизующие высшие пептиды, содержащие в молекуле не менее трех аминокислот. В группе пептидаз различаются аминополипептидазы, активность которых обусловливает присутствие свободной аминогруппы, и карбоксипептидазы, требующие присутствия свободной карбоксильной группы.

Все солодовые пептидазы имеют оптимальный pH в слабощелочной области между pH 7 и 8 и оптимальную температуру около 40°С. При pH 6, при котором протекает протеолиз в прорастающем ячмене, активность пептидаз ярко выражена, в то время как при pH 4,5-5,0 (оптимум протеиназ) пептидазы инактивируются. В водных растворах активность пептидаз снижается уже при 50°С, при 60°С пептидазы быстро инактивируются.

Ферменты, расщепляющие сложные эфиры фосфорной кислоты

При затирании большое значение придается ферментам катализирующим гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты.

Отщепление фосфорной кислоты технически очень важно из-за ее непосредственного влияния на кислотность и буферную систему пивоваренных полупродуктов и пива.

Природным субстратом солодовых фосфоэстераз являются сложные эфиры фосфорной кислоты, из которых в солоде преобладает фитин. Это смесь кзльцисвых и магниевых солей фитиновой кислоты, которая является гексафосфорным сложным эфиром инозита. В фосфатидах фосфор связан как сложный эфир с глицерином, в то время как нуклеотиды содержат фосфорный эфир рибозы, связанный с пиримидиновым или пуриновым основанием.

Важнейшей солодовой фосфоэстеразой является фитаза (мезоинозитгексафосфатфосфогидролаза, ЕК 3.1.3.8). Она очень активна. От фитина фитаза постепенно отщепляет фосфорную кислоту. При этом образуются различные фосфорные сложные эфиры инозита, которые в конце концов дают инозит и неорганический фосфат. Наряду с фитазой были описаны также сахарофосфорилаза, нуклеотидпирофосфатаза, глицерофосфатаза и пи- рофосфатаза.

Оптимальный pH солодовых фосфатаз находится в относительно узком диапазоне - от 5 до 5,5. К высоким температурам они чувствительны по-разному. Оптимальный температурный интервал 40-50°С очень близок к температурному интервалу пептидаз (протеаз).