§ 1. Дрожжи

В основе одной из главных стадий виноделия (брожение виноградного сусла) лежит процесс спиртового брожения, осуществляемый живыми клетками дрожжей. В процессе брожения сахар, содержащийся в соке, сбраживается дрожжами, в результате чего образуется спирт и углекислый газ.

Спиртовое брожение было известно человечеству с древности и на протяжении тысячелетий применялось для получения алкогольных напитков. Однако сущность этого процесса стала известна сравнительно недавно. Только в XV-XVI вв. появляются работы, в которых затрагиваются вопросы о связи между осадком, образующимся во время брожения, и продуктом, получающимся в результате брожения. Но так как осадок нельзя было рассмотреть простым глазом, то невозможно было и объяснить состав и сущность осадков в бродящих жидкостях. Только изобретение микроскопа голландцем Антонием Левенгуком в конце XVIII в. позволило проникнуть в новый, неизвестный человеку мир.

Более 100 лет назад Каньяр-Латур, Шванн и Кютцинг установили, что брожение является результатом физиологической деятельности живых организмов - дрожжей, накапливающихся в осадке во время брожения. Эта смелая мысль о связи процессов брожения с жизнедеятельностью живых существ была нова и неожиданна. В течение многих лет эта теория не имела признания, поскольку в то время признавалась только химическая теория брожения Либиха.

В 1857 г. Луи Пастер, основоположник современной микробиологии, опубликовал работу, в которой доказывал, что спиртовое брожение может протекать только в присутствии живых дрожжей и является результатом особой формы жизнедеятельности без доступа воздуха. Между Либихом и Пастером завязалась ожесточенная полемика, так как последний нанес сокрушительный удар господствовавшим в то время взглядам на брожение. Но опыты Пастера были настолько доказательны и точны, что химическая теория брожения отошла в прошлое.

В 1866 г. Пастер в работе "Исследование вина" доказал, что вина портятся в результате процессов, вызываемых микроорганизмами. Для борьбы с "болезнями" вин он предложил прогревать их до 55-60°С после того, как вино разлито в бутылки. Этот прием получил название "пастеризация".

В конце 70-х гг. прошлого столетия Ганзен разработал метод выделения чистых культур дрожжей из одной клетки. С такими культурами он вел исследования по систематике грибов, изучил их виды, расы, изменчивые формы.

Однако еще довольно долго считали, что дрожжи не самостоятельная группа организмов, а лишь форма развития грибов на определенной стадии. Только к концу XIX в. было признано, что дрожжи представляют собой самостоятельную группу организмов, хотя они и родственны грибам. Ввиду их способности сбраживать сахара они получили ботаническое название сахарных грибов (сахаромицес).

Дрожжевые организмы в настоящее время, подразделяются на две большие группы: настоящие, истинные дрожжи (спорообразующие) и дрожжеподобные организмы (не образующие спор). Те и другие организмы широко распространены в природе. Они встречаются в почве виноградников, на зеленых и опавших листьях, в почках и соцветиях виноградной лозы.

В районах предприятий бродильной промышленности и, в частности винодельческих заводов, территория, помещения и аппаратура содержат массу дрожжей. Здесь дрожжи сохраняются живыми в течение всего года и служат пищей для личинок и взрослой уксусной мушки, муравьев, пчел, ос и других насекомых, посещающих плоды, поэтому дрожжи почти всегда можно найти на винограде, яблоках, грушах. В период дробления и прессования винограда дрожжи попадают в сок и быстро в нем размножаются.

Качество изготовляемого вина зависит от качества перерабатываемого винограда и технологии виноделия. Оба эти показателя тесно связаны с микроорганизмами, которые находятся на поверхности винограда и, попав в сусло, продолжают развиваться. Причем преобладающее большинство составляют сорняки брожения (дикие дрожжи, бактерии и плесневые грибы); истинных винных дрожжей, которые ведут главный процесс брожения виноградного сусла, гораздо меньше.

Таким образом, спонтанное (самопроизвольное) брожение виноградного сусла, протекающее в результате случайного сочетания различных дрожжей, не может обеспечить получение вина высокого качества. Поэтому для получения полностью выброженных здоровых виноматериалов необходимо соблюдать рациональный режим брожения в первичном виноделии, основанном на использовании чистых культур отселекционированных дрожжей, а также принимать меры для защиты вин от вторичной инфекции при их обработке и выдержке.

Формы, размер и строение клеток дрожжей

Дрожжи - это одноклеточные но подвижные микроорганизмы, имеющие разнообразную форму: шаровую, овальную или эллипсовидную, яйцевидную, лимонообразную, цилиндрическую и т. д. Диаметр клеток достигает 1-5 мк, а длина - 1-10 мк и более. Одна и та же культура может состоять из клеток различной формы и размеров. Поэтому форму и величину данного вида дрожжей определяют в период их развития в жидкой питательной среде. Характерными являются клетки преобладающей формы и размеров.

Клетки дрожжей состоят из оболочки, цитоплазмы (протоплазмы) и ядра (рис. 1). В протоплазме с ее органоидами (вакуолями, хондриосомами, микросомами) и включениями (волютином, жиром, гликогеном и другими запасными питательными веществами) протекают важнейшие ферментативные процессы.

Рис. 1. Схема строения дрожжевой клетки: 1 - оболочка, 2 - хондриосомы, 3 - волютин, 4 - гликоген, 5 - делящееся ядро, 6 - вакуоль

Протоплазматическое вещество каждой дрожжевой клетки окружено прозрачной проницаемой оболочкой, которая в основном и определяет форму клетки. Через оболочку в клетку проникают питательные вещества. У молодых клеток оболочка очень тонкая, но с возрастом она утолщается.

Протоплазма имеет вид сероватой мелкозернистой полужидкой массы. У молодых клеток она однородна - гомогенна. При старении клетки в протоплазме может появляться мелкая вакуолизация и равномерная зернистость от мелкой до более крупной.

Видимая зернистость определяется появлением жировых липоидных и других гранулярных образований.

В вакуолях (органоид клетки) содержатся растворенные в воде электролиты, белки, жиры, углеводы и ферментные системы. Хондриосомы (митохондрии) - мелкие структуры, имеющие форму зернышек, нитей, играют важную роль в углеводном и жировом обмене. При специальном окрашивании хондриосомы можно наблюдать в обычный микроскоп.

Ядро играет важную роль в размножении клеток. При микроскопировании его не видно, и обнаруживается оно, лишь в результате специальной окраски.

Размножение клеток

Дрожжи размножаются почкованием или делением (вегетативное размножение), а также путем образования аскоспор (половое размножение).

При почковании часть протоплазмы и ядерного вещества перетекает из материнской клетки в растущую почку - маленький бугорок на оболочке материнской клетки. У основания почки образуется перетяжка, разделяющая молодую клетку с материнской. У дрожжей пылевидного типа почка, достигнув размеров материнской клетки, отделяется и начинает самостоятельную жизнь. У дрожжей хлопьевидного типа дочерние клетки, сидя на материнской, продолжают почковаться и образуют крупные конгломераты (хлопья), которые быстро оседают на дно бродильного сосуда. Если же в питательной среде недостаточно того или иного вещества или имеется ядовитое вещество, то процесс роста клеток замедляется и клетка может образовать несколько мелких почек в разных местах (множественное почкование - 3-4 почки), причем некоторые из них могут быстро отмирать. Почкованием размножаются дрожжи семейства Сахаромицетацеа (рис. 2).

Рис. 2. Сахаромицес вини (по В. И. Кудрявцеву)

Дрожжи могут размножаться и путем поперечного деления. Материнская клетка растет, удлиняется, посредине нее возникает перегородка, которая делит клетку на две равные дочерние. Так размножаются делящиеся дрожжи семейства Шизосахаромицетацеа (рис. 3).

Рис. 3. Шизосахаромицес Помбе (по В. И. Кудрявцеву)

Почкованием и делением размножаются дрожжи семейства Сахаромикодацеа. Образующийся вначале на материнской клетке почковидный вырост с широким основанием отделяется потом поперечной перегородкой (рис. 4).

Рис. 4. Сахаромикодес Людвигии (по В. И. Кудрявцеву)

У многих дрожжей известен половой процесс, причем у разных дрожжей он различен. Могут копулировать клетки и в результате образуется аск - клетка с 1-9 спорами. Могут копулировать споры в аске. Формирование аскоспор (опор, находящихся в асках) - это процесс размножения и образования форм, более устойчивых к неблагоприятным условиям.

Стадии развития дрожжей

Размножение характеризуется наличием большого количества почкующихся клеток с однородной плазмой и тонкой оболочкой (рис. 5, а).

Рис. 5. Стадии физиологического состояния дрожжей (схема): а - размножение, б - мертвые клетки, в - автолизированные клетки, г - покоящиеся клетки, д - аски со спорами

Во время брожения дрожжи в основном находятся в виде отдельных клеток. Клетки имеют зернистую протоплазму, мелкие вакуоли и большой запас питательных веществ; при обильном углеводном питании они накапливают гликоген.

Голодание клеток наступает после сбраживания всего сахара в сусле. Клетки становятся сравнительно мельче, и протоплазма приобретает зернистый вид.

Отмирание клеток происходит в результате длительного хранения дрожжевого осадка в вине при недостатке или полном отсутствии кислорода воздуха. Клетки дрожжей деформируются, протоплазма отстает от оболочки (рис. 5, б). У мертвых клеток дрожжей можно наблюдать автолиз - расщепление белков под влиянием собственных протеолитических ферментов. Количество протоплазмы у автолизирующихся клеток постепенно уменьшается, клетки становятся почти пустыми с небольшими капельками жира (рис. 5, в).

Покоящиеся клетки (рис. 5, г) наблюдаются при долгом пребывании дрожжей в осадке вина с доступом кислорода воздуха. В этих условиях клетки остаются жизнеспособными главным образом за счет органических кислот.

Стадия спорообразования наступает у молодых, хорошо питавшихся клеток при свободном доступе воздуха и при недостатке питания (рис. 5, д). Споры многих видов дрожжей имеют характерную для них формуй размер. Споры могут сохраняться продолжительное время, а попадая в благоприятные условия, прорастают, дают начало вегетативным клеткам.

Обмен веществ

Для построения компонентов протоплазмы, обеспечивающих рост и размножение организма, необходимы затраты энергии и различных веществ. Расход этих веществ пополняется за счет элементов питания, которые поступают из окружающей среды. Поглощенные клеткой питательные вещества идут по двум основным направлениям: часть их ассимилируется и перерабатывается в компоненты протоплазмы, другая часть разлагается и окисляется, освобождая нужную для жизни энергию.

Основное питание дрожжей - углеродное и азотное. Углерод необходим им для роста и получения энергии. Наиболее благоприятными источниками углерода для развития дрожжей являются сахара, глицерин, лимонная, яблочная кислоты и др. Источником азотистого питания для синтеза белков и других азотсодержащих соединений в клетке могут быть органические и неорганические аммиачные формы азота, аминокислоты, пептоны. Необходимы также различные неорганические элементы для создания нормальной структуры клетки. Кроме того, для развития дрожжей необходимы витамины.

Необходимую для жизни энергию дрожжи получают в процессе дыхания или в процессе спиртового брожения. В присутствии кислорода воздуха дрожжи получают энергию за счет дыхания, окисляя энергетический материал до углекислого газа и воды. При этом они выделяют наибольшее количество энергии:

В анаэробных условиях (без доступа воздуха) или при ограниченном доступе кислорода воздуха дрожжи получают энергию при расщеплении углеводов на спирт и углекислый газ, т. е. в процессе спиртового брожения:

Одна граммолекула сахара (180 г) при дыхании выделяет 674 ккал тепла, а при брожении - 27 ккал, т. е. в 25 раз меньше. Объясняется это тем, что спирт (конечный продукт) содержит значительное количество потенциальной энергии - 325 ккал на 1 граммолекулу. Таким образом, небольшое количество энергии, получаемое при спиртовом брожении, дрожжи восполняют способностью сбраживать большие количества сахара.

Спиртовое брожение

Алкогольным, или спиртовым, брожением называется процесс разложения микроорганизмами Сахаров на спирт и углекислый газ. Этот процесс используется при производстве спирта, глицерина, вина, пива, шампанского и других продуктов. Главными возбудителями спиртового брожения являются дрожжи рода Сахаромицес. Наибольшее практическое значение в виноделии имеют дрожжи вида Сахаромицес вини.

Приведенное выше уравнение спиртового брожения Гей-Люссака (2) указывает только на начальные и конечные продукты.

В действительности же превращение сахара в спирт и углекислый газ является сложным ферментативным процессом, состоящим из многих промежуточных реакций. Наряду со спиртом и углекислым газом из сахара образуются небольшие количества так называемых вторичных продуктов брожения: глицерина, органических кислот, сложных эфиров, альдегидов, высших спиртов и др. Для виноделия образование вторичных продуктов при брожении имеет громадное значение. Букет вина, качественные особенности его во многом зависят от соотношения вторичных продуктов, образование которых различно для каждого вида дрожжей. Букет вина также зависит от побочных продуктов брожения, которые образуются не из сахара, а из других веществ, находящихся в сбраживаемых субстратах, главным образом из аминокислот в результате их потребления дрожжами в ходе брожения и размножения.

Взаимодействие дрожжей с окружающей средой

Одним из наиболее важных факторов, влияющих на жизнь дрожжей, является температура. Оптимальная температура для развития винных дрожжей -25-30°С, максимальная -40°С, минимальная -4°С.

При температуре свыше 30°С процессы размножения и брожения ускоряются, однако дрожжи быстро отмирают. Если брожение началось при благоприятной температуре, то дальнейшее понижение ее до 11-12°С почти не сказывается на бродильной способности дрожжей.

Губительная температура для дрожжей - 60-70°С. Действие высокой температуры немного ослабляется присутствием Сахаров.

В период размножения (почкования) для дрожжей необходим кислород воздуха.

Давление дрожжи переносят хорошо. Бродильная способность дрожжей задерживается лишь при давлении свыше 1 ати, вызванном углекислым газом, образовавшимся при брожении.

Сахара в сусле в количестве 18-20% легко сбраживаются винными дрожжами. Дрожжи способны сбродить 25% Сахаров, более высокая концентрация замедляет брожение. В концентрированных сахарных растворах (выше 60%) дрожжи гибнут из-за потери воды. Зигосахаромицеты способны развиваться в субстратах с высоким осмотическим давлением, обусловленным содержанием Сахаров до 80% и выше.

Спирт задерживает брожение. Большинство дрожжевых организмов прекращает свое развитие при концентрации спирта 6-8% об., а брожение останавливается при 14-15% об. Некоторые расы дрожжей вида Сахаромицес вини сбраживают сахар до 16% об. спирта, а дрожжи вида Сахаромицес овиформис - до 18% об. С повышением температуры возрастает ядовитое действие спирта на дрожжи.

Кислые среды благоприятны для развития и жизнедеятельности дрожжей. Последние хорошо переносят яблочную и молочную кислоты, несколько хуже - винную и лимонную. Оптимальная величина рН для развития большинства дрожжей 3,5-4,5. Брожение при низких значениях рН задерживает развитие болезнетворных бактерий; при рН ниже 2,6 развитие дрожжей угнетается.

Сернистая кислота применяется в виноделии как антисептик и антиоксидант. Дрожжи обладают большой устойчивостью к ней. Сульфитация дозами 150-200 мг/л общей SO₂ при температуре 20-25°С задерживает размножение винных дрожжей и обеспечивает осветление сусла во время отстаивания. При концентрации SO₂ до 50 мг/л брожение задерживается на 18-24 ч, при содержании SO₂ 75-100 мг/л - на 2-4 суток, а при 200 мг/л - на 6-8 суток.

Однако следует отметить, что основное количество введенного в вино и сусло сернистого ангидрида находится в связанном состоянии (в соединении с сахарами, уксусным альдегидом, красящими веществами), а антисептическим действием обладает только свободная сернистая кислота (20-30% от введенного количества). Сусло из разных сортов винограда по-разному связывает сернистую кислоту.

Брожение сильно засульфитированных сусел следует вести на дрожжах, приученных к высоким дозам SO₂.

Настоящие винные дрожжи

Представители дрожжей, которые имеют положительное или отрицательное значение в технологии виноделия, подразделяются на 2 группы: 1) настоящие винные дрожжи, 2) сорняки брожения (дикие дрожжи).

К настоящим винным дрожжам относятся дрожжи видов Сахаромицес вини и Сахаромицес овиформис.

Сахаромицес вини. Основным местообитанием этих дрожжей являются соки ягод и сочных плодов, идущих для приготовления вина. Форма и размеры клеток зависят от условий развития и питательной среды. В большинстве случаев дрожжи этого вида имеют овальную или эллиптическую форму клеток, иногда округлую (см. рис. 2). Они обладают способностью глубоко сбраживать сахара виноградного сусла с образованием больших количеств спирта (до 16% об.) и очень малых количеств летучих кислот (до 1 г/л). При брожении эти дрожжи не образуют плохо пахнущих летучих эфиров и придают вину тонкий букет и хороший вкус.

Вид дрожжей Сахаромицес вини включает большое количество рас, малоотличающихся внешне, но значительно - по силе брожения, по отношению к воздействиям температур, по кислотовыносливости, по сульфитостойкости и др. Поэтому для изготовления разного типа вин имеет важное значение выбор рас дрожжей.

Сахаромицес овиформис. Чистая культура этих дрожжей хорошо развивается в вине, при брожении виноградного сусла может образовать около 18% об. спирта. При совместном развитии в плодово-ягодных соках дрожжи описываемого вида вытесняются более распространенными и более сильными дрожжами Сахаромицес вини. И наоборот, при забраживании спиртованных вин всегда выделяются дрожжи вида Сахаромицес овиформис. Следовательно, последние более приспособлены к обитанию в вине.

Разновидностью дрожжей этого вида являются хересные дрожжи, характерная особенность которых - способность к образованию пленки на поверхности сброженного субстрата. При сбраживании виноградного сусла хересными дрожжами образуется осадок, а по окончании брожения - через 10-15 дней (иногда раньше, в зависимости от концентрации спирта) на вине образуется пленка.

Рост пленки чаще всего начинается с образования отдельных небольших островков, которые, соединяясь друг с другом, образуют сплошную, тонкую, творожистого вида пленку. С возрастом цвет пленки меняется от белого, розовато-палевого до серого, темно-серого. В старых культурах или при неблагоприятных условиях пленка темнеет и постепенно опадает.

Оптимальной температурой развития хересной пленки является 18-20°С. В присутствии 16-17% об. спирта эти дрожжи хорошо развиваются на поверхности виноградного вина, окисляют спирт в альдегид. Последний наряду с ацеталями, образующимися при взаимодействии спирта с альдегидами, придает специфический букет хересу.

Дикие дрожжи (сорняки брожения)

Ганзениаспора апикулята. Эти дрожжи хорошо известны под названием апикулятус. Они небольшого размера, клетки заострены на одном или на обоих концах, их форма напоминает лимон. В зрелых культурах встречаются овальные и удлиненные клетки (рис. 6).

Рис. 6. Ганзениаспора апикулята (по В. И. Кудрявцеву)

Попав в сусло, апикулятусы размножаются в нем гораздо быстрее винных дрожжей, выделяют горькие вещества, много летучих кислот и эфиров. После накопления в бродящем сусле 3-6% об. спирта апикулятусы отмирают, уступая место более спиртовыносливым дрожжам. Продукты их жизнедеятельности тормозят брожение, ослабляя бродильную способность винных дрожжей.

Они являются причиной недобродов, портят аромат и вкус вина.

Апикулятусы очень чувствительны к сернистому ангидриду (погибают при 70 мг/л); поэтому их развитие легко подавить сульфитацией сусла при отстаивании (доза - 100 мг/л).

Шизосахаромицес. Это делящиеся дрожжи (см. рис. 3). Отдельные виды этого рода широко используются в винокуренной промышленности Аргентины и Мексики, что объясняется их способностью развиваться при повышенной температуре и давать при этом большой выход спирта.

Делящиеся дрожжи, развивающиеся в плодово-ягодных соках (особенно яблочных), вызывают катастрофическое снижение кислотности. Яблочная кислота расщепляется до углекислоты и воды, в результате чего соки и вина портятся.

Сахаромикодес Людвигии. Клетки дрожжей крупных размеров овальной, лимоновидной, подошвообразной формы (см. рис. 4). Образуют до 12% об. спирта и очень сульфитостойки, поэтому сохраняют свою активность в течение всего процесса брожения сусла. Эти дрожжи выделяют вещества, приостанавливающие размножение и угнетающие бродильную способность винных дрожжей, а также портят вино, придавая ему неприятный привкус.

Пленчатые дрожжи. К группе пленчатых дрожжей относятся дрожжи родов Ганзенула, Пихия, Зигопихия, Дебариомицес, Бреттаномицес, Кандида микодерма и другие, известные в виноделии под общим названием микодермы. Они размножаются почкованием и разрастаются на поверхности вина в виде тонкой, а затем толстой морщинистой пленки. Клетки непрочно соединены между собой, поэтому при встряхивании жидкости пленка опадает. Пленчатые дрожжи энергично окисляют спирт, кислоты, глюкозу и другие вещества вина до углекислоты и воды. Рост этих дрожжей прекращается только при 12% об. спирта. Некоторые из них могут жить и в глубине сусла или вина, сбраживая сахара с образованием летучих кислот и уксусноэтилового эфира, оказывающих неблагоприятное влияние на вкус вина.

Брожение на чистых культурах дрожжей

Спонтанное (самопроизвольное) брожение возникает в тех случаях, когда сусло оставляют для брожения, не добавляя в него чистых культур дрожжей. В сусле начинают беспорядочно размножаться попавшие в него с ягод микроорганизмы, состав и количество которых могут быть разнообразными. Сначала преобладают наиболее быстро размножающиеся, но менее спиртостойкие дрожжи-сорняки (апикулятусы и пленчатые). По мере накопления в сусле спирта все они постепенно отмирают, уступая место более спиртоустойчивым винным дрожжам.

Вина, сброженные на диких дрожжах или при большом их участии, плохо осветляются, часто содержат недоброженный сахар, легче заболевают и имеют плохие вкусовые качества.

Чтобы не допустить развития посторонней микрофлоры в виноградном сусле, в практику виноделия введены сульфитация сусла и его отстаивание. После отстаивания сульфитированного сока вместе с осадком удаляются и винные дрожжи. Поэтому для ведения брожения в сусло вводят разводку чистой культуры винных дрожжей с заранее известными, ценными для производства свойствами. Количество разводки должно достигать 2% и больше от объема всего сусла, подлежащего сбраживанию, т. е. 2 дкл на каждые 100 дкл сусла. Если сусло приготовлено из загрязненного, поврежденного или больного винограда, количество вносимой дрожжевой разводки должно быть увеличено до 4-5%.

Вина, готовящиеся на чистых культурах дрожжей, обычно равномерно бродят, полнее выбраживают, быстро осветляются, имеют хороший вкус и аромат и устойчивы против заболеваний. Количество спирта, образуемого в вине, увеличивается на 0,5-1,0%.

К чистым культурам дрожжей относят дрожжи, выделенные из одной клетки и специально подобранные путем селекции для приготовления определенных типов вин - столовых, шампанских, полусладких, десертных и др. Коллекция чистых культур ВНИИВиВ "Магарач"^* содержит свыше 400 рас винных дрожжей, взятых из разных винодельческих районов Советского Союза. Ежегодно перед началом сезона виноделия институт отправляет чистые культуры винных дрожжей в пробирках по заявкам винзаводов совхозов и колхозов.

^* (Всесоюзный научно-исследовательский институт виноделия и виноградарства "Магарач".)

В настоящее время для приготовления различных типов вин рекомендуются следующие расы дрожжей:

для приготовления шампанских и белых столовых виноматериалов: Феодосия 1-19 (спиртовыносливая, сульфитостойкая), Пино 14 (спиртовыносливая), Ленинградская (спиртовыносливая, холодовыносливая), Ужгород 67 (спирто- и сульфитоустойчивая), Серсиаль 14, Кахури 7, Ашхабад 3 (термовыносливая);

для крепких и десертных виноматериалов: Массандра III (хлопьевидная, спиртовыносливая), Судак VI-5 (хлопьевидная, кислото- и спиртовыносливая);

для красных столовых виноматериалов: Каберне 5, Бордо, Саперави 46;

для приготовления столовых полусладких вин: Новоцимлянская 3 (склонна к недобродам, бродит без образования пены);

для вин типа херес: Херес 20-С, Херес 96;

для производства шампанского бутылочным методом: Судак VI-5, Кахури 7, Кахури 2;

для резервуарной шампанизации: Ленинградская, Ркацители 6.