Определение форм кислорода в сусле и вине

Из всех наиболее важных факторов, от которых зависит изменение продукта, на первое место нужно поставить кислород и связанные с ним окислительно-восстановительные процессы, протекающие в биологическом субстракте.

Применительно к винограду, суслу и вину, кислород влияет на следующие процессы: на накопление или разрушение в винограде эфирных масел; на энергию дыхания гроздей; на интенсивность растворения металлов при переработке винограда; размножение бродильной микрофлоры в сусле и вине; изменение сортового аромата и разрушение букета выдержки; накопление перекисных форм в сусле и вине, что обуславливает в дальнейшем последействие окислительного воздействия, выражающегося в аморфных помутнениях.

Не случайно, что научной классификацией, предложенной Г. Г. Агабальянцем, в основу деления на категории и типы вин положена степень их окисленности.

Для определения кислорода в сусле и вине вполне зарекомендовал себя прибор конструкции Кочерги и Кульневича (рис. 5). Он состоит из сосуда А для приготовления и хранения раствора гидросульфита; сосуда Б для титрования раствора индикатора и вина; сосуда В для удаления из вина растворенного в нем кислорода путем продувания углекислого газа; микробюретки Е емкостью 5 миллилитров с делениями по 0,05 миллилитра; пипетки Д для титрования раствора нейтрального красного; кранов, соединительных трубок и двух склянок Тищенко с водой Г и Г₁ для наблюдения за током газа. Одновременно эти склянки служат гидравлическими затворами^*.

^* (В. К. Кульневич. Определение различных форм кислорода в вине. Журн. "Виноделие и виноградарство СССР", 1954, № 6.)

Рис. 5. Аппарат для определения форм кислорода

Прежде чем приступить к работе, аппарат необходимо промыть и удалить из него воздух. Для этого в сосуды А и В через отверстия К и М наливают дистиллированную воду, которую затем вытесняют углекислым газом в сосуд Б и далее, через кран 8, - в канализацию. Закрыв все краны и открыв кран 5, наливают в сосуд А 50 миллилитров буферного раствора и 70-80 миллилитров воды, включают газ и 10 минут продувают смесь, с тем чтобы удалить растворенный в ней кислород.

Затем через отверстие К в сосуд А вносят 0,3 грамма гидросульфита и наливают воду с таким расчетом, чтобы раствор дошел до деления 150 миллилитров. Закрыв отверстие К, током СО₂ хорошо перемешивают раствор до тех пор, пока он не станет прозрачным. Тогда им несколько раз ополаскивают бюретку Е, наполняют ее, закрывают краны 4, 5, 10 и открывают краны 6, 7. Через сосуд В в сосуд Б наливают немного воды для ополаскивания. Закрыв отверстие М и краны 6, 7, сбрасывают воду в канализацию.

После того как закроют кран 8 и откроют краны 6, 7, можно начать определения.

Для работы нужны специальные растворы: 0,2М буферный раствор соды (56,0 г/л Na₂Co₃ · 10Н₂О); раствор гидросульфита (2,5 г/л), приготовляемый непосредственно в сосуде А) раствор индигокармина (0,5 г/л); 0,03-0,04N раствор KMnO₄ с точно установленным титром; 10-процентный раствор серной кислоты и 0,1-процентный раствор нейтрального красного в 60-процентном; спирте.

Кислородное число O_x определяют следующим образом. Через сосуд В при помощи пипеток последовательно вносят в сосуд Б 20 миллилитров раствора индигокармина и 15 миллилитров щелочного буфера.

Закрывают краны 3, 6 и отверстие М и включают ток СО₂, регулируя его так, чтобы индикатор равномерно барботировался СО₂. Через 15 минут индигокармин оттитровывают гидросульфитом и фиксируют полученный отсчет (n).

Затем бюретку Е вновь наполняют раствором восстановителя, открывают кран 6 и 1-1,5 минуты продувают СО₂ сосуд В,

В бескислородных условиях в пипетку, воздух из которой предварительно вытеснен СО₂, отбирают 50 миллилитров вина из пробоотборника (рис. 6). Потом вставляют пипетку с вином в отверстие М так, чтобы она коснулась крана 3 (рис. 5) и переливают из нее вино в сосуд Б, предварительно открыв кран 1 на атмосферу.

Закрывают отверстие М и краны 3, 6 и, открыв кран 2, приливают струей восстановитель из бюретки Е. Кран 1 поворачивают в прежнее положение и, обеспечивая равномерное, но не сильное перемешивание смеси током СО₂, быстро титруют ее до тех пор, пока не станет грязно-зеленоватого цвета, а затем постепенно дотитровывают, пока смесь не перестанет светлеть от капли раствора гидросульфита. Полученный отсчет (m) записывают.

Рис. 6. Пробоотборник исследуемого материала

Сразу после приливания вина в сосуд Б перемешивать смесь СО₂ не следует, так как углекислый газ может захватить часть молекулярно растворенного в вине кислорода. В том случае, когда в вине мало растворенного кислорода, что хорошо видно по окраске индикатора, ток СО₂ можно включать сразу.

Расчет кислородного числа O_x исследуемого вина производится по формуле

где O_x - количество кислорода, содержащегося в литре вина, мг;

O_u - количество кислорода, необходимое для перевода литра раствора индигокармина из лейкоформы в окрашенную (титр эталонного раствора по кислороду), мг;

n - количество восстановителя, необходимое для перевода взятого объема раствора индигокармина в лейкоформу, мл;

m - количество гидросульфита, потраченное на восстановление индигокармина, окисленного за счет кислорода, содержащегося в пробе вина, мл.

O_u определяют титрованием 50 миллилитров рабочего раствора индигокармина 0,03-0,04N раствором KMnO₄ в кислой среде и рассчитывается в мг/л по уравнению

где а - количество раствора KMnO₄, мл;

к - поправочный коэффициент к 0,1N раствору KMnO₄.

Расчет перекисного числа Оп производят также по формуле (1), причем в нее подставляют значения n₁, m₁ или m₂.

Перекисное число О_п определяют следующим образом. Через сосуд В при помощи пипеток последовательно вносят в сосуд Б 20 миллилитров раствора индигокармина и 15 миллилитров щелочного буфера.

Закрыв кран 5, наливают в сосуд В 50 миллилитров исследуемого вина, не остерегаясь соприкосновения его с кислородом воздуха. Закрывают пробкой отверстие М и включают углекислый газ, ток которого регулируют кранами 6 и 7, так, чтобы и индикатор и вино равномерно барботировались. Через 15 минут закрывают кран 6 и титруют раствор индигокармина восстановителем. Полученный отсчет (n₁) записывают.

Затем бюретку Е вновь заполняют раствором гидросульфита и, открыв краны 6 и 3, перепускают в сосуд Б вино, лишенное молекулярного растворенного кислорода. Смесь хорошо перемешивают углекислым газом и снова титруют.

Полученный отсчет (m₁) записывают. После этого жидкость сбрасывают в канализацию или, если необходимо определить содержание трудно восстанавливаемых перекисей, открыв кран 6 и отверстие М, наливают в сосуд В 8-10 миллилитров воды и миллилитр раствора нейтрального красного. Через отверстие М вводят в сосуд В конец пипетки Д и оттитровывают индикатор гидросульфитом до исчезновения красной окраски (количество израсходованного гидросульфита не учитывают). Затем вынимают конец пипетки Д, закрывают отверстие М и переводят индикатор в сосуд Б.

Закрыв краны 3 и 6, смесь перемешивают и оттитровывают до исчезновения красноватого оттенка и пока от прилипания 2-3 капель гидросульфита вино не перестанет светлеть. Отсчет, полученный в результате титрования при обоих индикаторах (m₂), фиксируют. После этого сбрасывают жидкость из сосуда Б и ополаскивают аппарат.

Содержание молекулярно растворенного в вине кислорода (в мг/л) определяют по формуле

Для качественного анализа газа в баллоне на отсутствие кислорода используется небольшой переносный аппарат (рис. 7).

Рис. 7. Прибор для определения форм кислорода

В сосуд А наливают 30-40 миллилитров 0,2 М раствора Na₂CO₃ и вносят 0,3 грамма гидросульфита. Закрыв сосуд пробкой а, хорошо встряхивают смесь. В сосуд Б наливают 25-30 миллилитров раствора соды и на кончике ножа вносят немножко индигокармина. После этого, закрыв отверстие пробкой б, вставляют в нее сосуд А и подключают аппарат к баллону. Затем включают ток СО₂ или азота и оттитровывают раствор индигокармина гидросульфитом до появления устойчивой желтой окраски (не перетитровывать!). Если в течение 10-15 минут продувания раствор не изменит свою окраску, то газ может быть использован для проведения анализов, так как метод обладает большой чувствительностью.

Для отбора пробы вина в бескислородных условиях и сохранения ее до проведения анализа использовался пробоотборник.

При помощи трубки 1 пробоотборник присоединяют к баллону с СО₂, 5-10 минут продувают углекислым газом, закрывают трубки 1 и 2 стеклянными пробками и переносят к месту отбора пробы.

Способность того или иного вещества захватывать электроны, т. е. окислять, можно непосредственно измерить, вводя в раствор индифферентный металлический электрод (платиновый). Причем для установления на электроде характерного и постоянного потенциала нужно время и тем большее, чем больше различия в потенциалах.

По нашим опытам, для устранения возможной ошибки электроды должны быть заранее (за 2 часа) погружены в аналогичное, а еще лучше в определяемое вино, так как окисленные электроды будут показывать потенциал на 20-30 процентов больше, а восстановленные - на 25-40 процентов меньше.

Для измерения Eh, rh, pH нами использовался ламповый потенциометр ЛП-59.

Анализ содержания кислорода в сусле и корости его потребления помогает осветить ряд важных биологических и химических процессов в первичном и вторичном виноделии. Однако для потребления молекулярного кислорода нужен активированный катализатор, принимающий на себя водород или электроны окисляемого органического вещества.

По Манской (1947), окислительные процессы в вине и коньяке протекают по следующей схеме. Вначале происходит автоксидация фенолов и красящих веществ (пирокатехин, танин антоциан) за счет кислорода воздуха с образованием перекисей. В дальнейшем процесс окисления активизируется пероксидазой или металлическими катализаторами, действующими по типу пероксидазы за счет этих перекисей.

Хотя эта простая схема Манской экспериментально подтверждена, но действительность, по-видимому, богаче, а процессы в биологическом субстрате проходят значительно быстрее, чем в очищенных растворах гидрохинона.

В настоящее время известно не менее 400 ферментов, из которых около половины участвует в окислительно-восстановительных реакциях (Михлин, 1956).

Значительную работу по идентифицированию и дифференциации различных ферментативных систем виноградного сусла и вина провел А. К. Родопуло. С этой целью им были применены специфические субстраты и ингибиторы. Нами была использована эта методика.

В качестве субстрата для изучения активности полифенолоксидазы служил пирокатехин, для аскорбиноксидазы - аскорбиновая кислота, для каталазы - перекись водорода и для цитохромоксидазы - цитохром С и гидрохинон.

В качестве ингибитора для полифенолоксидазы был взят диэтилдитиокарбамат. Этот реактив является специфичным для ферментов, содержащих медь, и в то же время не мешает действию железосодержащих ферментов - пероксидазы, цитохромоксидазы и каталазы.

Активность полифенолоксидазы устанавливается по поглощению кислорода в респирометрах Варбурга, а пероксидазы - по Прокошеву.

Подготовка вытяжки. 50 граммов свежего винограда растирают в фарфоровой ступке с 20 миллилитрами ацетатного буфера (рН 4,7). Смесь оставляют на полчаса для экстракции, затем жидкость сливают в мерную колбу на 100 миллилитров, а оставшуюся рыхлую массу промывают (экстрагируют) 3 раза ацетатным буфером с декантацией. Декантируемую жидкость сливают в ту же колбу на 100 миллилитров и доводят дистиллированной водой до метки

Затем часть вытяжки центрифугируют 15 минут при 3000 оборотов в минуту для определения в ней активности фермента.

В респирометр Варбурга вносят смесь, состоящую из 3 миллилитров вытяжки из винограда (фермент), 1,5 миллилитра фосфатного буфера рН 5,3 (готовится путем смешения ортофосфорной кислоты с ее натриевой солью), 1,0 миллилитра 1-процентного раствора пирокатехина. Во внутренний стаканчик помещают фильтровальную бумагу с 0,3 миллилитра 20-процентного раствора КОН. Параллельно ставят сосуд с той же смесью, но без пирокатехина Сосуды соединяют с манометрами и помещают в ванну аппарата Варбурга. Опыты проводятся при температуре 30 градусов.